Genetic Diversity Analysis of Chaenomeles Speciosa (Sweet) Nakai Based on ISSR Molecular Markers

Jiang Xiaogang ^1,2　Lin Xianming ^1,2　Zhang Meide ^1,2　Wang Hua ^1,2　Guo Kunyuan ^1,2*

1 Institute of Chinese Medicinal Materials, Hubei Academy of Agricultural Sciences, National Traditional Chinese Medicine Industry Technology System Enshi Comprehensive Test Station, Enshi, 445000; 2 Hubei Agricultural Science And Technology Innovation Center Chinese Medicinal Materials Sub-Center, Enshi, 445000

* Corresponding author, gtdrenhe@163.com

Abstract　In order to study the genetic diversity and genetic relationship of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai from different producing areas, 10 ISSR polymorphic primers were used in the polymorphism and cluster analysis of 12 Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai germplasm resources in the main producing areas. The results showed that the percentage of polymorphism of each primer ranged from 65% to 100%, and the genetic similarity coefficient of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai germplasm resources ranged from 0.505 7 to 0.862 1. The genetic information of various interstitials was abundant. Cluster analysis divided 12 accessions into 3 groups, and the first group was divided into 2 subgroups. Among them, the relationship of M4 (Sangzhi County-1, Hunan Province) and M7 (Sangzhi County-2, Hunan Province) was closest, the relationship of M1 (Eryuan County, Yunnan Province) and M10 (Yunxi County, Hubei Province) was farthest. These results indicate that there is a high genetic diversity of 12 Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai germplasm resources in the main producing areas of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai in China.

Keywords　Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai, ISSR molecular marker, genetic diversity, genetic relationship

皱皮木瓜Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai，又名贴梗海棠、贴梗木瓜等，属于蔷薇科木瓜属植物，以干燥熟果实入药，富含苹果酸、酒石酸、枸椽酸等大量有机酸，还含有过氧化氢酶、鞣质、果胶、黄酮类等物质(Ros et al., 2004; Du et al., 2013; Miao et al., 2016; Zhang et al., 2016; 张明发和沈雅琴, 2018)。皱皮木瓜原产于我国西南部，随着不断的变迁，现湖北、四川、安徽、山东、浙江、陕西、云南等省均有种植，已形成资丘木瓜、宣木瓜和川木瓜等多个木瓜主产区(王明明等, 2009; 杨松杰, 2011; Shao et al., 2017)。皱皮木瓜味酸，性温，具有很高的药用价值和营养价值(Xie et al., 2015; 李聪等, 2018; 朱夏雨等, 2019)。

皱皮木瓜在我国种植历史悠久，种植面积广阔，具有很大的开发潜力，但是由于目前木瓜属植物生药性状较为相似，市场上混伪品较多，药材质量极不稳定，这给物种鉴定及安全用药带来了较大的不便，因此对木瓜属药用植物进行快速准确的鉴定就显得尤为重要和迫切。本研究选取了国内12个皱皮木瓜主产区的成熟皱皮木瓜作为实验材料，提取它们基因组DNA，在获得适宜的DNA提取方法及ISSR-PCR优化扩增体系基础上，筛选适宜的引物对这12种木瓜的基因组 DNA 进行PCR扩增，希望通过这些研究阐明12 个皱皮木瓜资源的遗传多样性和亲缘关系，为后期木瓜属药用资源的鉴别分类提供一定研究基础。

1结果与分析

1.1基因组DNA提取与检测

提取的12份皱皮木瓜种质基因组DNA条带清晰、无拖尾，用中药材通用条形码ITS₂引物扩增各基因组DNA，各条带明亮清晰，条带大小基本一致(图1; 图2)，以上结果表明提取的皱皮木瓜基因组DNA质量较高，可用于后续ISSR遗传多样性分析。

图1 12份皱皮木瓜基因组DNA电泳图 注: M: DL2000DNA Marker; 1~12: 12份皱皮木瓜基因组DNA Figure 1 Twelve genomic DNA electrophoretogram of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai Note: M: DL2000DNA Marker; 1~12: Twelve genomic DNA of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai

图2 12份皱皮木瓜ITS2扩增结果 注: M: DL2000DNA Marker; 1~12: 12份ITS2扩增结果 Figure 2 Twelve ITS2 amplification results of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai Note: M: DL2000DNA Marker; 1~12: Twelve ITS2 amplification results

1.2 ISSR引物扩增多态性

用优化的ISSR-PCR体系从100条ISSR引物中筛选出10条多态性引物用于皱皮木瓜遗传多样性分析(图3; 表1)，10条引物在12个样本中扩增出511条条带，其中多态性条带数为355，多态性条带百分率为75.3％；共扩增出87个位点，其中多态性位点数为74，多态性位点百分率为85％。各引物多态性百分率范围为63％~100％，其中引物U873扩增位点数和多态性位点数最多(都为16条)，引物U847、U848、U850、U858、U873多态性条带和多态性位点百分率最高，都为100％。扩增结果表明12个产地的皱皮木瓜基因型都不同，且具有丰富的遗传多样性。

图3 引物U873对12份皱皮木瓜资源的扩增结果 注:nM: DL2000DNA Marker; 1~12: 12份皱皮木瓜资源的扩增结果 Figure 3 Amplification results of twelve Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai resources by primer U873 Note: M: DL2000DNA Marker; 1~12: Amplification results of twelve Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai resources

表1 多态性ISSR引物信息及扩增情况 Table 1 Polymorphism ISSR primer information and amplification

1.3遗传相似性和遗传距离分析

用NTSYS-pc2.10e软件对不同产地皱皮木瓜种质资源之间的遗传相似性系数(GS)和遗传距离(GD)进行分析，12份皱皮木瓜种质GS值范围为0.5057~0.8621，平均GS值为0.713 7，变幅为0.356 4，大部分种质的GS值在0.7500~0.8200之间，其中GS最大值和GD最小值在M4和M7之间，分别为0.862 1和1.463 5，说明M4和M7之间的遗传相似程度最高，亲缘关系最近；M1和M10之间的GS值最小，GD最大，表明两者间的遗传相似程度最低，亲缘关系最远(表2)。

表2 12份皱皮木瓜材料遗传相似系数和遗传距离 注: M1~M12材料编号见表3; 表格对角线上方表示遗传距离, 对角线下方表示遗传相似系数 Table 2 Genetic similarity coefficient and genetic distance of twelve Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai materials Note: M1~M12 materials coding name are are shown in Table 3, Genetic distance (above diagonal) and genetic similarity  coefficient (below diagonal)

1.4聚类分析

用NTSYS-pc2.10e软件对12份皱皮木瓜材料进行聚类分析(图4)，系统聚类遗传一致度范围为0.56～0.86，平均值为0.71，因此可将12份材料由上至下划分为3组，第一组又可划分为两个亚组，第一亚组包括M1、M2、M3、M6，第二亚组包括M4、M7、M12、M5、M9、M8，第二组为M11，第三组为M10。

图4 12份皱皮木瓜聚类分析 注: M1: 云南省洱源县; M2: 云南省云县; M3: 重庆市纂江县; M4: 湖南省桑植县-1; M5: 山东省河东区-1; M6: 四川省宣汉县; M7: 湖南省桑植县-2; M8: 贵州省正安县; M9: 山东省河东区-2; M10: 湖北省郧西县; M11: 陕西省洋县; M12: 安徽省宣城市 Figure 4 Cluster map of twelve Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai resources Note: M1: Eryuan County, Yunnan Province; M2: Yun County, Yunnan Province; M3: Chongjiang County, Chongqing City; M4: Sangzhi County, Hunan Province (1); M5: Hedong District, Shandong Province (1); M6: Xuanhan County, Sichuan Province; M7 : Sangzhi County, Hunan Province (2); M8: Zheng'an County, Guizhou Province; M9: Hedong District, Shandong Province (2); M10: Yunxi County, Hubei Province; M11 : Yang County, Shanxi Province; M12: Xuancheng, Anhui Province

2讨论

研究木瓜属种质资源遗传多样性，对于解决种源混杂问题，建立品种分类体系，及进一步的育种研究非常重要(王明明等, 2010)。新型分子标记技术相比传统的形态、细胞学、生化标记技术，具有标记数量较多、多态性较高，易检测的优势。比如ISSR分子标技术，已被应用在多个物种如植物、微生物等的遗传多样性分析中，而对于木瓜属遗传多样性研究的报道较少，王明明等(2010)通过SRAP分子标记技术将32份木瓜栽培材料划分为毛叶木瓜种系、西藏木瓜、皱皮木瓜种系、日本木瓜种系4个类群，通过揭示4个种系间的亲缘关系，发现皱皮木瓜种系分化程度较高。夏永秀等(2010)基于21份西藏木瓜属种质材料筛选了28对条带清晰、多态性丰富的引物，为遗传多样性分析奠定基础。目前对皱皮木瓜的研究多集中在利用品质性状评价方法间接揭示皱皮木瓜种系的差异，发现不同产地皱皮木瓜的有机酸、黄酮、多酚、多糖等含量存在着显著差异(陈亚楠等,2019)，这些研究为利用分子标记技术揭示皱皮木瓜遗传多样性提供了依据。

本研究采用ISSR分子标记技术对12份全国皱皮木瓜资源进行了遗传多样性和亲缘关系分析。多态性ISSR引物扩增发现，引物U847、U848、U850、U858、U873多态性条带数和位点数百分率都达到100％，各引物百分率≥63％，表明12份皱皮木瓜具有较丰富的遗传信息。遗传相似性分析发现，12份皱皮木瓜种质资源GS值范围为0.5057~0.8621，平均GS值为0.7137，表明了12份皱皮木瓜资源存在一定遗传差异，这与陈亚楠等(2019)通过品质性状评价方法揭示不同产地皱皮木瓜的差异相互验证，研究表明地理分布与亲缘关系具有相关性，相近地理位置种质倾向聚为一类(Wilson et al., 2001)。本研究将12份皱皮木瓜种质资源从上至下划分成3组，第1组包括2个亚组，其中M4(湖南省桑植县-1)和M7(湖南省桑植县-2)亲缘关系最近，M1(云南省洱源县)和M10(湖北省郧西县)亲缘关系最远，进一步分析发现，M1(云南省洱源县)和M2(云南省云县)、M4(湖南省桑植县-1)和M7(湖南省桑植县-2)、M5(山东省河东区-1)和M8(贵州省正安县)分别聚类到一起，表明产地越近的木瓜品种，亲缘关系往往更近，这也进一步证实了本研究结果的可靠性，以上研究将为皱皮木瓜种质资源鉴定及筛选提供一定基础。

3材料与方法

3.1供试材料

试验材料包括湖北、湖南、安徽等12个皱皮木瓜主产地的木瓜样品，样品编号、产地、地理位置等信息(表3)。

表3 12份皱皮木瓜信息 Table 3 The information of twelve Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai resources

3.2基因组DNA提取及检测

采用新型植物基因组DNA试剂盒(北京天根生物科技有限公司)提取新鲜皱皮木瓜果实的基因组DNA，用分光光度法和琼脂糖电泳检测DNA的浓度和质量，保存于-20℃备用。用中药材通用条形码ITS2引物(F: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'; R: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3')检测DNA是否存在PCR反应抑制物。

3.3多态性ISSR引物筛选和扩增

本研究所用引物由上海英俊公司合成，选取两个产地木瓜DNA模板，通过优化的ISSR-PCR体系筛选了10条多态性好、重复性好、且条带清晰的ISSR引物，优化的20 μL PCR体系为：模板DNA 50 ng，2×Taq mix 10μL，2.5 μmoL/L引物2 μL，ddH₂O 7 μL。

3.4数据处理

在胶图上同一水平位置，有条带的记为1，无条带的记为0，用Excel软件对数据进行整理，采用NTSYS-pc2.1软件计算遗传相似系数(GS)和和遗传距离(GD)，基于遗传相似系数矩阵，利用UPGMA法进行聚类分析。

作者贡献

蒋小刚是本研究的执行人，完成论文初稿的写作；林先明和张美德协助完成实验；王华协助完成数据分析处理；郭坤元是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-21)、第三批“湖北省青年英才开发计划”项目、湖北省技术创新专项(鄂西民族专项2019AKB092)和恩施州科技计划研究与开发项目(D20180016)共同资助。

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